Czy naprawdę jesteś tatusiem?

W ostatnich latach można zauważyć rosnącą popularność testów na ojcostwo. Obecnie są one najbardziej popularną i jednocześnie wiarygodną metodą weryfikacji biologicznego ojcostwa. Badanie DNA jest najdokładniejszym sposobem weryfikacji spornego ojcostwa. Za jego pomocą możliwe jest potwierdzenie biologicznego ojcostwa z prawdopodobieństwem 99,99%, bądź też wykluczenie ze 100% pewnością.
Dzięki postępowi nauki, opracowywane są coraz mniej skomplikowane metody analizy. Dzięki temu i rosnącej popularności testów systematycznie obniża się także ich koszt jednostkowy. Samo badanie DNA jest badaniem prostym, bezbolesnym i względnie szybkim (w zależności od metody badania). Dzięki temu badania DNA są uznanym dowodem sądowym w sprawach kryminalnych i cywilnych. Kod genetyczny jest unikalny i zawiera go każda komórka organizmu. Cząsteczki ludzkiego DNA pogrupowane są w 46 chromosomów, tworzących 23 pary. W trakcie procesu zapłodnienia, w wyniku rekombinacji powstaje nowy unikatowa sekwencja kodu DNA u potomstwa (inna niż każdego z rodziców, a będąca ich w przybliżeniu przypadkową kombinacją), posiadająca podobnie jak u rodziców 46 chromosomów połączonych w pary. Pary te pochodzą w połowie od każdego z rodziców – 23 z plemnika ojca i 23 od z komórki jajowej matki. Dzięki temu mechanizmowi dziedziczone jest DNA, a wraz z dokładnym rozpoznaniem mechanizmu dziedziczenia, możliwe stało się wykonywanie testów porównawczych domniemanego rodzica oraz dziecka. Mężczyzna może być biologicznym ojcem danego dziecka w momencie, gdy połowa kodu genetycznego dziecka jest zgodna z odpowiednią częścią (połową) jego kodu. Wykonywanie tego typu porównań oraz ogromna ich precyzja jest możliwa dzięki zjawisku polimorfizmu DNA. Poliformizm DNA oznacza, że część kodu DNA jest identyczna u wszystkich przedstawicieli gatunku, a część unikalny dla danej jednostki. Obszarem badań porównawczych są właśnie te unikalne część kodu, które porównuje się u dziecka i domniemanego rodzica. Dzięki tak przeprowadzanym testom DNA, otrzymujemy pewną lub prawie pewną odpowiedź.

1) Metoda PCR – Reakcja łańcuchowa polimerazy (ang. Polymeraze chain reaction)
2) Analiza RFLP – Polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych (ang. Restriction Fragments Length Polymorphism)
Trzecia metoda – Metoda Real Time PRC (ang. Real-time PCR) to modyfikacja standardowej metody PRC.

Aby wykonać test DNA w kierunku ustalenia ojcostwa niezbędny jest materiał genetyczny dziecka oraz domniemanego ojca. W przypadku testów prywatnych bada się tylko cechy dziedziczone po ojcu, dlatego materiał genetyczny matki jest wymagany tylko w określonych przypadkach. Dzieje się tak wówczas, gdy u dziecka wystąpi mutacja, bądź też wtedy, gdy bada się dwóch domniemanych ojców blisko ze sobą spokrewnionych. Standardowym źródłem materiału genetycznego jest wymaz z wewnętrznej strony policzka. Istnieje także możliwość wyizolowania DNA z niestandardowych źródeł takich jak np. szczoteczka do zębów, bądź włos wyrwany wraz z cebulką. Firmy oferujące usługi w zakresie ustalania ojcostwa coraz bardziej dostosowują się do potrzeb klienta.

PCR (ang. Polymerase Chain Reaction) – jest łańcuchową reakcja polimerazy, metodą stosowaną do replikowania łańcuchów DNA w warunkach laboratoryjnych, polegającą na naprzemiennym wielokrotnym podgrzewaniu i wychładzaniu próbki, Metoda ta została wypracowana przez Kary’ego Mullisa, w 1983 roku. Za odkrycie to Mullis został uhonorowany nagrodą Nobla, 10 lat później.
Reakcja PCR składa się z wielokrotnie powtarzanego cyklu trzech etapów, które zachodzą w rożnych temperaturach (denaturacja, hybrydyzacja, elongacja z syntezą). Można zatem wymuszać je bez ingerencji w skład mieszaniny, a jedynie przez zmianę temperatury mieszaniny reakcyjnej. PCR pozwala na stosunkowo szybkie powielenie wybranego fragmentu DNA oraz w następstwie określenie jego długości. Dzięki niej możliwe jest ustalenie czy poszukiwana sekwencja znajduje się w analizowanej próbce. Osiąga się to przez startery, krótkie odcinki kodu DNA, będące komplementarnymi w stosunku do sekwencji sąsiadujących z fragmentem, będącym celem replikacji. Następnie do badanej próbki dodaje się substraty do syntezy DNA (trifosforany deoksyrybonukleozydów), enzym zdolny do jej przeprowadzania (termostabilną polimerazę DNA) , tzw. bufor (roztwór utrzymujący stałe pH) oraz wcześniej wspomniane startery. Rozrost jest na tyle szybki, że prowadzi do zwielokrotniania pożądanego fragmentu DNA w postępie geometrycznym.

PCR znajduje wiele zastosowań, m.in. w badaniach nad genomem, charakterystyce ekspresji genów, klonowaniu genów, diagnostyce klinicznej, identyfikacji osób zaginionych, potwierdzaniu ojcostwa, kryminalistyce. Szczególnie powszechne jest stosowanie metody PCR do rozmaitych testów DNA na ojcostwo. Metoda cechuje się ponad 99% skuteczną w teście pozytywnym (potwierdzenie ojcostwa) i 100% skutecznością w teście negatywnym (zaprzeczenie ojcostwa). Ze względu na stosunkową prostotę analizy kodu DNA metodą PCR i powszechności jej użycia, cena pojedynczego testu waha się od 700 do 2000 złotych, w zależności od ośrodka wykonującego badanie, czasu oczekiwania na wynik oraz wymogów proceduralnych.

RFLP (ang. Restriction Fragments Length Polymorphism) – oznacza polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych. Badania genetyczne metodą RFLP polegają na wykrywaniu różnic w rozmiarach fragmentów DNA, dzięki czemu organizmy mogą być rozpoznawane poprzez analizę wzorów pochodzących z podziału ich DNA. RFLP oznacza odmienność fragmentów kodu genetycznego pochodzącego od różnych osobników, pociętych specyficznymi enzymami restrykcyjnymi. Odmienność ta polega na różnicach w długości fragmentów DNA, które powstają w wyniku mutacji, powodowanych przez tworzenie lub usuwanie miejsc rozpoznanych przez określone enzymy. DNA genomu badanej osoby przecinane jest przez enzym restrykcyjny z grupy endonukleaz w określonych miejscach o charakterystycznej sekwencji nukleotydów, precyzyjnie rozpoznawanej przez ów enzym. W zależności od liczby miejsc restrykcyjnych w DNA i odległości pomiędzy nimi, otrzymujemy określoną liczbę fragmentów restrykcyjnych o specyficznej długości. Zastosowanie techniki RFLP polega właśnie na analizie różnic badanych fragmentów DNA. Analiza metodą RFLP obejmuje takie etapy, jak: pobranie i izolacja DNA, trawienie DNA enzymami restrykcyjnymi, rozdzielenie elektroforetyczne, przygotowanie hybrydyzacji Southerna, hybrydyzacja DNA z radioaktywną sondą  i wykrywanie polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych. Komplet uzyskanych w ten sposób obrazów składa się na pełny profil analizowanego DNA. W poszczególnych etapach, materiał genetyczny jest pobierany, preparowany i analizowany w celu uzyskania wiarygodnego i miarodajnego rezultatu. Próbka może zostać pobrana z dowolnej tkanki, w szczególności może to być krew, nasienie, włosy lub ślina.

Analiza DNA metodą RFLP znajduje wiele zastosowań we współczesnym świecie. Jest kluczowym narzędziem stosowanym do rozpoznawania DNA. Łatwość identyfikacji DNA przy badanu krwi, włosów śliny i innych wydzielin sprawiła, że metoda ta jest m.in. szeroko wykorzystywana w kryminalistyce. Ponadto, powszechnie w medycynie przy badaniach defektów genetycznych i dziedziczenia cech osobniczych. Metoda ta, może służyć do potwierdzania lub negowania pokrewieństwa między osobnikami, na podstawie występowania lub braku występowania różnych alleli. Metoda RFLP jest również wykorzystywana w bioprzemyśle, w której organizmy mogą być różnicowane poprzez analizę wzorów pochodzących z pocięcia ich DNA. Metoda RFLP wiąże się jednak z dość dużą pracochłonnością podczas procesu analizy oraz koniecznością pobierania rozległych ilości materiału badawczego, stąd też nie jest optymalna do powszechnego użycia. Dlatego też, często ustępuje miejsca innym metodom analizy DNA, jak choćby RAPD, AFLP czy nawet PCR.
Metoda RFLP nie jest optymalna w stosowaniu, jeśli analiza ma dotyczyć dużej grupy osobników ze względu na stosunkowo wysoki jednostkowy koszt analizy. Koszt ten wynika przede wszystkim z wieloetapowego i wysublimowanego procesu analizy.  Z tego powodu, metoda ta znajduje zastosowanie w ściśle określonych obszarach badań naukowych bądź praktycznych. Należy zaznaczyć, że istnieją mutacje metody RFLP, przede wszystkim upraszczające proces analizy i tym samym cechujące się mniejszym kosztem jednostkowym.

Kolejną i obecnie zdobywającą coraz większą popularność i uznanie metodą jest PCR w czasie rzeczywistym. Metoda Real Time PRC to modyfikacja standardowej metody PRC. Jest to tzw. reakcja łańcuchowa polimerazy DNA z analizą ilości produktu w czasie rzeczywistym (ang. Real-time PCR). Real time pozwala oszacować ilość badanego fragmentu DNA, jaka znajdowała się w próbce na samym początku. Metoda ta „wyewoluowała” z konwencjonalnej reakcji PCR, przy czym dzięki wykorzystaniu różnych technik fluorescencji pozwala na monitorowanie przyrostu ilości produktu reakcji w czasie. Po każdym cyklu amplifikacji, specjalne urządzenie dokonuje pomiaru fluorescencji, której intensywność jest wprost proporcjonalna do ilości kopii DNA. Ważną zaletą PCR w czasie rzeczywistym jest fakt, że zarówno amplifikacja jak i detekcja produktu odbywa się w jednym naczyniu, co ogranicza ryzyko zanieczyszczenia praktycznie do zera. Detekcja przyrostu liczby kopii umożliwiona jest tu dzięki zastosowaniu starterów wyznakowanych fluorescencyjnie lub odpowiednich fluoryzujących związków chemicznych wykazujące wysokie powinowactwo do podwójnej nici DNA. Real time wymaga termocyklera, który w swojej budowie sprzężony będzie z fluorymetrem – urządzeniem służącym do pomiaru fluorescencji.

Metoda Real Time PRC jest bardzo wrażliwą metodą analityczną, znajduje ona szerokie zastosowanie w genetyce i biologii molekularnej. Już dziś PCR w czasie rzeczywistym jest jednym z głównych narzędzi stosowanych w badaniach flavivirusów, hepadnawirusów, herpeswirusów, orthomyxowirusów, parvowirusów, wirusów papowa paramyxowirusów, picornawirusów oraz retrowirusów, a także pacjentów oczekujących na przeszczep i tych, którzy przechodzą rekonwalescencję już po zabiegu. Badanie ilości syntetyzowanego produktu w czasie rzeczywistym pozwala na przyśpieszenie badania, poprzez eliminacje etapu szacowania produktu po początkowej i w końcowej fazie reakcji. Metoda Real-Time PCR jest obecnie najczulszą metodą diagnostyczną powszechnie stosowaną głównie w krajach Europy Zachodniej.